• 可针对3’端甲基化（2′-O-Me）修饰的小RNA进行通用型cDNA合成 
• 可凭借单一cDNA合成反应进行成熟植物miRNA表达谱分析
• 可凭借单一cDNA合成反应进行piRNA的表达谱分析

miScript Plant RT Kit是针对具有3’端甲基化(2′-O-Me)修饰的小RNA进行无偏差 cDNA合成的通用型试剂盒。本试剂盒专为基于实时定量PCR技术的小RNA表达分析应用设计和优化，能够配合miScript SYBR Green PCR Kit和miScript miRNA PCR Array或miScript Primer Assay等产品使用。这一类通过功能验证的分析和芯片产品可应用于水稻、玉米、大豆、烟草和其他一些重要农业作物的检测，以及植物学相关的研究。在3’ 末端碱基具有2′-O-Me甲基化修饰的小RNA（如植物成熟miRNA和piwi互作RNA (piRNA)）中，一般不具有poly A尾结构，因此无法通过多聚腺苷酸依赖的cDNA合成方法有效地反转录。专用的miScript Plant RT Kit通过首先向植物miRNA的3’末端连接一个接头解决了这一难题。不同于多聚腺苷酸化，这一链接反应不会受到植物miRNA 3’末端碱基上存在的2′-O-Me甲基化修饰的负面抑制。接头一旦连接成功，即可实现反转录反应。

原理

成熟的miRNA一般是长度为22个碱基的非编码RNA，能够介导转录后的基因调控。植物的miRNA和piRNA会在其3’末端碱基上形成2′-O- Me形式的甲基化修饰。因此，植物miRNA和piRNA的通用cDNA合成，需要通过连接反应来实现后续的反转录反应。

连接反应介导的反转录

miScript Plant RT Kit包含了针对植物成熟miRNA样本进行连接反应介导的通用型反转录所需的全部试剂；这些试剂包括10x miScript Ligation Buffer，10x miScript Plant Adaptor，2x miScript Ligation Activator，miScript Plant RNA Ligase，10x miScript Plant RT Nucleics，5x miScript Plant RT Buffer以及miScript Plant Reverse Transcriptase。进行连接反应介导的反转录时，小RNA被选择性地转换为cDNA。在反应的第一步，成熟的miRNA与一个接头相连接。在反 应的第二步，连接好的miRNA被反转录为cDNA。

10x miScript Plant Adaptor包含了一个经过优化的预腺苷化接头，及一个人工合成的对照RNA（miScript Plant Ligation Control [miPLC]），后者被用于评估连接反应介导的反转录的反应性能。10x miScript Plant RT Nucleics包含了dNTPs、RT引物和一个合成的RNA-DNA杂交内参（miScript Plant Reverse-Transcription Control [miPRC]），后者也被用于检测反转录的反应性能。我们的5x miScript Plant RT Buffer产品具有正在申请专利的特有配方，能够促进成熟miRNA向cDNA的选择性转化，从而实现后续使用miScript miRNA PCR Array或miScript Primer Assay的miRNA定量操作。  

通过real-time PCR进行miRNA的表达谱分析

使用miScript miRNA PCR Array（其中包含针对特定miRNA的miScript Primer Assay）和miScript SYBR Green Kit（其中包含miScript Universal Primer（反转录引物）和QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix）进行real-time PCR分析时，可采用miScript Plant RT Kit制备的cDNA做为模板。需要鉴定成熟miRNA的表达谱时，可向miScript miRNA PCR Array中加入含有cDNA、miScript Universal Primer、QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和去RNA酶水的混合物。

通过real-time PCR进行miRNA表达水平的定量

使用植物的miScript Primer Assay和miScript SYBR Green Kit产品进行Real-time PCR分析时，使用miScript Plant RT Kit制备的cDNA可做为模板。需要对成熟miRNA的表达水平进行定量时，可制备含有cDNA、miScript Primer Assay、miScript Universal Primer、QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix和去RNA酶水的混合物，并加入到PCR反应管、Rotor-Disc或平板中。

操作流程

反转录反应可方便地进行。通常在连接反应介导的反转录反应中，一般使用含有3’端2′-O-Me修饰小RNA的总RNA做为起始材料。反转录是一个简单直 接的操作步骤，包含了37℃下1小时的温育反应，以及之后在95℃下通过短暂孵育对反应进行失活。

应用

miScript Plant RT Kit通常做为miScript Plant PCR System的一部分，用于进行：

• 植物成熟miRNA的定量和表达谱分析
• piRNA的定量和表达谱分析